标准集团（香港）有限公司：由上海市环境科学学会、江苏省环境监测协会、浙江省环境监测协会联合组织编制的团体标准《水质 发光细菌 高通量急性毒性测试方法》已形成征求意见稿。按照《上海市环境科学学会团体标准管理办法》、《江苏省环境监测协会团体标准管理办法(试行)》、《浙江省环境监测协会团体标准管理办法(试行)》的有关要求，现公开征求意见。

　　本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的规定起草。参考GB/T 5750.2 生活饮用水标准检验方法水样的采集与保存；GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法；GB 17378.3 海洋监测规范 第3部分：样品采集、贮存与运输；HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范；HJ 91.1 污水监测技术规范；HJ/T 164 地下水环境监测技术规范等规程编制。

　　本标准规定了高通量测定水质急性毒性的发光细菌法。本标准适用于测定地表水，地下水，饮用水、生活污水，工业废水及海水的发光细菌急性毒性。

　　方法原理：

　　发光细菌暴露在无毒性的水体中可以正常发光，当水体中含有环境毒物时，发光便会受到抑制，受抑制程度与毒物浓度之间有较好的正相关关系。本标准使用高通量的96孔板作为反应载体，通过生物发光检测仪测定系列稀释的环境水样(如地表水，地下水，饮用水、生活污水，工业废水及海水)与发光细菌接触一定时间后的发光强度变化，可以利用发光细菌的相对发光强度(Tt)、相对抑制率(Ht)与稀释系列浓度的曲线关系获得效应浓度(EC)、毒性当量(TEQ)、毒性单位(TU)或低无效应稀释度(LID)来表征水样的急性毒性水平并评价毒性程度。

　　仪器和设备：

　　1.适用于 96 孔板的、具有顶读及生物发光检测功能的仪器。2.pH 计：精确到 0.1 pH单位，测量范围从0到14。3.溶解氧测定仪：精确到0.1mg/L。4.盐度计：精确到0.1mg/L 或0.1%。5.电子分析天平：精度为0.0001g。6.培养箱：15℃，在一次测试中，温度偏差不超过±1 ℃。7.冰箱：冷藏温度2~8 ℃，冷冻温度-18 ℃以下。8.涡旋混合器。9.平板振荡器。10.单通道移液器：200μL、1mL、5mL、10mL。11.多通道移液器：200μL 。

　　样品的采集：

　　1.地表水、生活污水和工业废水的采集须符合HJ/T 91以及HJ 91.1要求的技术规范。2.地下水的采集须符合HJ/T 164要求的技术规范。3.饮用水的采集须符合GB/T 5750.2要求的技术规范。4.海水样品的采集须符合GB 17378.3要求的技术规范。

　　样品的保存：

　　采样瓶使用惰性材料制成(如聚四氟乙烯)，务必清洁、干燥。采样时，水样应该充满容器，不留空气，密封。样品保存在放有冰袋的保温箱内运送回实验室，6小时内分析。若样品不能及时分析，应在 2~8 ℃的黑暗环境下冷藏保存，但不得超过48小时。可在-18 ℃以下保存长达两个月。样品的保存不添加任何化学试剂。

　　样品测试：

　　每次试验设置空白对照、参比样品对照和样品组，每个组至少两个平行。可测试的小稀释度为 1→1.25(80%样品，D=1)，作为几乎未稀释的样品，可以通过将 4 体积的样品与 1 体积的细菌悬液(例如 160 µL 样品和 40 µL 细菌悬液)混合而制备，同时需要设置一个空白对照(D=1)，通过 40 µL 细菌悬液和 160 µL 稀释液进行配制。其他稀释系列是由样品试验溶液和细菌悬浮液等体积混合的，白对照(D=2)每孔加入 100 µL 细菌悬液和 100 µL 的稀释液，参比样品对照每孔加入 100 µL 细菌悬液和 100 µL 的参比样品溶液，样品组每孔加入 100 µL 细菌悬液和 100 µL的样品溶液(见附录 B)。

　　参比样品对照和样品组 96 孔板排列方式参见附录 C。在 96 孔板(6.10)中，使用多通道移液器(7.11)，每孔加入细菌悬液后，立刻置于测试温度下，等待 30 分钟后，用发光检测仪(7.1)测定发光强度，记录为 I0；然后将样品或稀释后的样品迅速加入到细菌悬液中，使用平板振荡器轻轻振荡摇匀(7.9)，并置于规定的测试温度下，在接触 5 分钟、15 分钟或 30 分钟时测定发光强度，分别记录为 I5、I15、I30，不同微孔板的测定间隔宜在 30 秒以内。

　　结果计算与表示：

　　测试结果可以使用相对发光强度(Tt)、相对抑制率(Ht)，也可以计算得到效应浓度(EC)、毒性当量(TEQ)、毒性单位(TU)或低无效应稀释度(LID)表示。

　　结果评价：

　　对于排放到自然水体中的任何废水(如生活污水、工业废水)，采用EC50值或 TU值评价样品的急性毒性，EC50 值越小，测试样品毒性越强；TU 值越大，测试样品毒性越强。